“APPROCCIO cellulare e molecolare per lo studio di nuovi pathway coinvolti nella disregolazione immunitaria intestinale: SINDROME DI IPEX/IPEX-LIKE e malattia del trapianto contro l’ospite come MODELLi di STUDIO “
Il concetto di disregolazione immunitaria come causa diretta di autoimmunità nelle malattie da immunodeficienza primaria (PIDDs) è stato rafforzato dalla scoperta di entità cliniche distinte legate a difetti di un singolo gene che sono causa di molteplici fenomeni autoimmuni, come la sindrome da Immunodisregolazione, Poliendocrinopatia, Enteropatia, X -linked (IPEX). Si tratta di una malattia genetica autoimmune causata da mutazioni nel gene FOXP3, codificante un fattore molecolare regola la trascrizione di diversi geni coinvolti nella risposta delle cellule T ed è fondamentale per lo sviluppo delle cellule T regolatorie CD4+CD25+ (Tregs) e per il mantenimento della tolleranza immunologica periferica. Nell’uomo l’espressione di FOXP3 non si limita alle Treg, ma è anche espresso transitoriamente nelle cellule T effettrici attivate, suggerendo il suo ruolo nella regolazione immunitaria al di fuori delle cellule Treg. Le cellule Treg formano quindi un sottogruppo di cellule T CD4 che si sviluppano nel timo (nTreg), o si differenziano in periferia da cellule T naive in presenza di TGF-b in seguito a stimolazione del recettore delle cellule T (iTreg).
IPEX è caratterizzata da grave diarrea, dermatite cronica, e endocrinopatie autoimmuni, che di solito includono diabete mellito ad insorgenza precoce insulino-dipendente (IDDM) e/o tiroidite. I pazienti sviluppano sintomi nella prima infanzia e la maggior parte muoiono prematuramente a causa di diarrea grave, assenza di risposta a immunosoppressione o infezioni gravi. Tuttavia, analogamente ad altri disturbi genetici del sistema immunitario (i.e. sindrome di Omenn ), il decorso della malattia è variabile e indipendente dal tipo di mutazione di FOXP3. Ulteriori fattori genetici o ambientali possono interferire con il decorso clinico della malattia e generare fenotipi discordanti. Inoltre, si osservano vari pazienti con caratteristiche cliniche dovute a disregolazione immunitaria sistemica e autoimmunità che coinvolge solitamente diversi organi, che non presentano mutazioni nel gene FOXP3 e sono generalmente definiti “IPEX -like”.
Diversi studi biochimici hanno indicato che FOXP3 può cooperare con partner multipli, assemblati in un complesso molecolare dinamico, per modulare la trascrizione genica e la funzione delle cellule T regolatorie. Diversi fattori genetici possono quindi essere responsabili della disregolazione immunitaria dei pazienti IPEX-like.
Le cellule Treg esprimono costitutivamente CD25, la subunità α del recettore trimerico per IL-2. L’IL2 svolge un ruolo critico nel mantenimento delle cellule Treg in vivo. Il legame di IL-2 al suo recettore attiva il trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5b (STAT5B), che trasloca nel nucleo e si lega al gene FOXP3, favorendo così la sua trascrizione. Sono stati riportati pazienti con mutazioni di STAT5B o IL2Ra (CD25) e hanno mostrato diminuzione del numero e della funzione delle cellule Treg e un fenotipo clinico simile a IPEX.
La trascrizione di IL2Ra è attivata dal complesso FOXP3-NFAT (fattore nucleare delle cellule T attivate), che si lega ai promotori di IL2 e CD25 rispettivamente sopprimendo e attivando la loro trascrizione. Inoltre, è stato dimostrato che RUNX1 interagisce con il complesso NFAT/FOXP3 nelle cellule Treg per sopprimere l’espressione del gene IL2 e attivare quella di CD25, e che il legame del complesso Runx alla regione regolatrice del gene FOXP3 può contribuire all’espressione costitutiva di FOXP3. Ulteriori studi hanno rivelato che l’assenza di RUNX1 nelle cellule Treg risulta in una attenuata espressione di FOXP3 e una alterata funzione soppressiva, che portano allo sviluppo di malattie autoimmuni e iperproduzione di IgE.
Altri studi hanno rivelato che FOXP3 inibisce l’attività trascrizionale di AP-1 legandosi selettivamente alla forma attiva di c-Jun e sequestrandolo dalla cromatina nella regione del promotore del gene IL2.
Inoltre, l’acetilazione di FOXP3 è una modificazione post-traduzionale necessaria che è regolata da componenti del complesso HAT/HDAC presenti nelle cellule Treg. Studi funzionali hanno dimostrato che TIP60 (appartenente alla famiglia HAT) e HDAC7 e HDAC9 sono associati in un insieme dinamico con FOXP3 in vivo, e che il reclutamento di FOXP3 da parte del complesso HAT/HDAC è essenziale per la repressione della produzione di citochine.
Infine, EOS è un fattore di trascrizione appartenente alla famiglia Ikaros. E’ altamente espresso nelle cellule Treg Foxp3+ e interagisce direttamente con un dominio specifico di FOXP3. Esperimenti funzionali hanno dimostrato che è necessario per la soppressione del gene IL2 da parte di FOXP3.
Dal punto di vista terapeutico, il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (TCSE) rappresenta ad oggi il miglior trattamento curativo per molti disturbi ematologici e per immunodeficienze ereditarie come la sindrome di IPEX. Una complicanza maggiore del TCSE è la malattia del trapianto contro l’osptite (Graft versus Host Disease, GvHD) che può essere considerata come una risposta infiammatoria accentuata da parte delle cellule del donatore contro antigeni estranei presenti nei tessuti del ricevente. La GvHD acuta che colpisce l’intestino produce manifestazioni cliniche e alterazioni istologiche simili a malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Molti studi suggeriscono che l’infiammazione intestinale è uno dei fattori che può influenzare la sopravvivenza post-trapianto.
E’ stato riportato che polimorfismi a singolo nucleotide in geni coinvolti nella regolazione del sistema immunitario possono influenzare la cascata infiammatoria e le reazioni immunitarie guidate dalle cellule T ed avere quindi un ruolo nell’insorgenza e decorso clinico della disregolazione immunitaria intestinale sia nelle immunodeficienze primitive che nella GvHD.
Lo scopo principale del progetto è quello di comprendere meglio l’omeostasi intestinale e di identificare biomarcatori che potrebbero essere in grado di predire l’insorgenza e la gravità della disregolazione immunitaria. Partendo dalla GvHD acuta intestinale dopo trapianto e dalle sindromi di IPEX e IPEX-like come modelli di enteropatia immuno-mediata, il nostro lavoro permetterà di investigare i vari fattori responsabili dell’immunodisregolazione intestinale.
I pazienti classificati come IPEX-like saranno arruolati per lo studio e, in base al fenotipo clinico e ai dati citofluorimetrici, saranno indirizzati all’indagine molecolare dei geni FOXP3 o CD25. I pazienti negativi per le mutazioni nei geni sopra citati saranno sottoposti all’analisi molecolare di un pannello di geni coinvolti nel pathway di FOXP3 mediante l’uso di tecniche Next Generation Sequencing (NGS). Contemporaneamente, per alcuni pazienti con particolare fenotipo clinico, verrà valutata l’eventualità di effettuare l’analisi dell’intero esoma mediante tecniche NGS.
Al fine di stabilire il significato patogenetico delle variazioni di sequenza identificate verrà valutato il loro effetto sulla struttura e la funzione del gene e della proteina. A questo scopo verranno eseguite l’analisi bioinformatica e successivi studi funzionali.
I pazienti sottoposti a TCSE verranno reclutati e seguito il loro decorso clinico post trapianto. Nei pazienti IPEX-like e in quelli sottoposti a TCSE in cui si osserva l’insorgenza di GvHD intestinale verrà effettuata l’analisi di polimorfismi specifici per stabilire se esiste una correlazione con l’insorgenza e il decorso dell’immunodisregolazione intestinale.
OBIETTIVI DEL PROGETTO
- Caratterizzare le basi molecolari e cellulari della patologia intestinale immuno-mediata
mediante l’analisi di geni coinvolti nello sviluppo e nella funzione delle cellule Treg, e tramite
il sequenziamento dell’esoma. - Valutare il possibile ruolo di SNPs nell’influenzare l’insorgenza di immunodisregolazione
intestinale - Valutare il ruolo dei marcatori individuati nello studio nell’insorgenza della GvHD intestinale
post trapianto
Nel complesso questi risultati aiuteranno ad acquisire nuove conoscenze nella comprensione dei meccanismi molecolari complessi di tolleranza immunologica che possono svolgere un ruolo importante nell’insorgenza e decorso dell’immunodisregolazione intestinale in pazienti affetti da immunodeficienze primitive e in pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche che presentano GvHD come complicanza post trapianto.